原标题:临床肿瘤基因检测湿实验常见质控问题分析
随着分子诊断的持续发展,肿瘤基因检测已经成为癌症患者应对癌症的一大武器,而基因突变检测前检测样本的采集、处理、保存及转运都会影响到基因检测结果的准确性。工欲善其事必先利其器,在基因检测中经常会出现哪些常见影响结果的问题呢?绘真医学专门梳理了以往样本检测中常见质控问题并逐个进行分析总结,供您参考。旨在尽可能规范样本采样送样流程,避免肿瘤患者因样本问题而贻误治疗时机,帮助患者顺利地获益于基因检测结果。
质控大类
一:血液溶血
血液样本中红细胞被破坏,血红蛋白及细胞中各成分释放入血清或血浆,当标本中游离血红蛋白含量>0.5g/L时称为溶血,超过10 g/L时为严重溶血[1]。
1. 血液溶血可能影响检测:
在传统临床检验、生化检验中,标本溶血时,红细胞破坏,细胞内容物释放,可因光学干扰、与试剂成分发生化学反应等机制对检验结果造成干扰,使检验结果假性升高或降低。
在基因检测中,标本溶血时红细胞破坏,细胞内容物释放,其中的盐离子、血红蛋白等可影响检测中各种试剂活性对检测结果造成干扰。除此之外在标本溶血时,白细胞也经常伴随着发生破坏。除了血液系统肿瘤患者,实体瘤患者白细胞中的人类基因组DNA几乎没有肿瘤相关基因突变,当这些基因组DNA随着白细胞破坏释放到血浆中,会极大程度稀释血浆中肿瘤来源的游离DNA(ctDNA),增加检验结果出现假阴性的风险。
2. 质检结果质控不合格描述:
2.1 严重溶血,无法继续检测。建议补送样本进行检测;
2.2 中度溶血,继续检测存在一定风险。建议补送样本进行检测。

3. 质控不合格可能原因分析:
溶血的原因主要为采血和转运过程操作不当以及刚做完化疗后采血。结合日常工作分析需提醒大家注意[1.2]:
3.1 化疗用药后患者采血需谨慎,采血前避免服用导致溶血类药物;
3.2 使用10毫升真空采血管,采血量要达到采血管真空度量刻度;
3.3 血液采集避免从血肿部位采血及反复进针采血;不要用静脉留置针、输液管等血管通路装置采血,应使用合适的细针头采血;
3.4 止血带使用后,要在1分钟之内采集血液,采血后及时平稳上下颠倒采血管,轻轻混匀;
3.5 标本转运过程中,避免标本剧烈震荡、环境温度过高过低、转运时间过长等因素;
3.6 注意患者是否有自身免疫性溶血,如血型不合输血;遗传、代谢病或中度感染等因素,如有,医师应在申请单上标注说明。
二:脂血
脂血是指血液里含脂肪较多,也就是血脂高的表现,部分患者抽血以后静置一段时间,会发现采血管中有一层漂浮的黄白色物质,也就是血脂。
1. 质检结果质控不合格描述:
严重脂血,无法继续检测,建议补送样本进行检测。

2. 质控不合格可能原因分析:
2.1 患者伴有原发性高脂血症(遗传因素)或继发性高脂血症(比如糖尿病、肾移植及不良饮食等因素)[3];
2.2 长期服用药物导致的高脂血症,如激素类药物等;
2.3 患者在高脂肪、高油脂用餐后或者输注脂肪乳后采集血液样本。
三:样本过小/细胞沉淀过少
送检样本经质控检测样本过小或体液样本离心沉淀后细胞过少。
1. 质检结果质控不合格描述:
1.1 送检组织在肉眼下未见明显组织细胞,无法继续检测,建议补送样本进行检测;
1.2 胸水离心后在肉眼下未见明显细胞沉淀,建议补送样本或改用备用血浆进行检测。

2. 质控不合格可能原因分析:
2.1 组织样本中未见明显组织细胞的原因主要包括:
2.1.1 送检组织样本尺寸过小,在肉眼下观察不到肿瘤细胞;
2.1.2石蜡块在包埋过程中,因组织过小而没有被固定在蜡块中。
2.2 胸水样本中未见明显组织细胞的原因主要包括:
2.2.1 所采的胸水中不含有肿瘤细胞或肿瘤细胞占总细胞的比例太低;
2.2.2 胸水送样前进行了离心操作,错将离心上清液送检;
2.2.3 部分肿瘤患者因合并肺栓塞、肺门淋巴结肿大、心功能不全、低蛋白血症等,引起继发性胸腔积液,胸腔积液中找不到肿瘤细胞[4]。
四:未见明确肿瘤细胞
送检样本经质控检测未见明确肿瘤细胞。
1. 质检结果质控不合格描述:
镜下未见明确肿瘤成分,建议补送样本进行检测。具体描述示例:
1.1镜下见极少肺泡组织,建议补送样本进行检测;
1.2 镜下见变性纤维和炭尘,建议补送样本进行检测;
1.3 镜下见纤维和红细胞,未见肿瘤细胞,建议补送样本进行检测;
1.4 肠道腺瘤样息肉,未见肿瘤细胞,建议补送样本进行检测;
1.5 镜下见纤维和血管,未见肿瘤细胞,建议补送样本进行检测;
1.6 镜下见少量增生的纤维组织伴变性,建议补送样本进行检测。
2. 质控不合格可能原因分析:
镜下未见明确肿瘤成分的原因包括:
2.1 送检的组织样本中没有观察到恶性肿瘤细胞,可能采集了周围炎症严重的组织、黏液产生过高的组织、病变中心广泛纤维化的组织等[5];
2.2 镜下所见无法判断为恶性肿瘤细胞,需要结合肿瘤患者病理诊断评估。

五:肿瘤细胞比例低/肿瘤细胞数量少
送检样本经质控检测到肿瘤细胞含量低于检测标准(检测标准:肿瘤细胞占比≥20%,肿瘤细胞个数≥100个)。
1. 质检结果质控不合格描述:
1.1 肿瘤细胞比例低于检测标准(即肿瘤细胞占比<20%),质控不合格,继续检测存在一定风险,请确认是否继续检测,或补送样本进行检测;
1.2 肿瘤细胞个数低于检测标准(即肿瘤细胞个数<100个),质控不合格,继续检测存在一定风险,请确认是否继续检测,或补送样本进行检测。

2. 质控不合格可能原因分析:
肿瘤细胞比例、肿瘤细胞个数低于检测标准的主要原因有:
2.1 送检的组织大部分为坏死细胞、肌肉细胞、软骨细胞等,而肿瘤细胞含量较少;
2.2 未取到肿瘤组织样本或所取组织中肿瘤细胞含量非常少;
2.3 组织取材时或取材后,物理挤压严重变形,而挤压区域难以确定肿瘤细胞含量。
六:cfDNA存在基因组污染
1. 质检结果质控不合格描述:
1.1 提取后cfDNA中存在基因组污染,继续检测存在一定风险,请确认是否继续检测,或补送样本进行检测。
2. 质控不合格可能原因分析:
提取后cfDNA中存在基因组污染的主要原因包括:
2.1 在采血时患者正在进行化疗,靶向治疗,输液,输血等治疗,可能导致血液中白细胞、正常组织细胞裂解,释放基因组DNA一定程度上稀释了ctDNA的浓度,导致ctDNA浓度相对偏低,增加了检验结果假阴性的风险。

七:石蜡切片脱片严重
1. 质检结果质控不合格描述:
1.1 石蜡切片脱片严重,无法继续检测,建议补送正电荷白片进行检测。

2. 质控不合格可能原因分析:
石蜡切片脱片的原因主要包括组织自身原因及载玻片类型不当,结合日常工作分析石蜡切片脱片原因主要包括[6]:
2.1 组织自身原因及处理不当,组织中富含血液成分、脂肪成分或者组织过硬,如干涸、坏死或者骨组织;
2.2 组织取材切片过厚(超过1.5cm X 1.5cm X 0.3cm),造成组织固定、脱水、透明不足,石蜡切片浸入不足或者不能浸入,勉强包埋,制片时切出的切片经过烤片、脱蜡、染液等步骤后易脱落;
2.3 组织脱水过程原因,程序设置不合理,脱水过程中无水乙醇和二甲苯的处理时间过长,温度过高或者石蜡长时间未更换;
2.4 制片过程中,切片破碎、有褶皱或烤片时间过短、温度过低及载玻片不洁净清晰度不佳等;
2.5 载玻片未使用正电荷防脱玻片。
八:血浆凝固
1. 质检结果质控不合格描述:
1.1 血浆凝固,无法继续检测,建议补送样本进行检测。

2. 质控不合格可能原因分析:
血液凝血的原因主要包括:
2.1 采血后未能将血液与抗凝剂仔细混匀,或混合不充分;
2.2 采血量过大,抗凝剂相对较少,未能充分发挥抗凝作用;
2.3 抽血时间过长,抽血不顺利,造成血液凝成小块;
2.4 压脉带使用时间过长,加速凝血因子凝固活性;
2.5 患者本身患有某些疾病,如高血脂、血液粘稠度高等。
九:组织样本自溶/坏死/挤压变形
1. 质检结果质控不合格描述:
1.1 组织自溶,细胞形态无法辨认,建议补送样本进行检测;
1.2 镜下见样本组织坏死,细胞破裂,无法检测。建议补送样本进行检测;
1.3 镜下见细胞挤压变形,无法清晰观察,继续检测存在一定风险,请确认是否继续检测,或补送样本进行检测。

2. 质控不合格可能原因分析:
2.1 组织自溶、坏死、挤压变形的主要原因可能为组织取出后没有立即放到固定液里面,导致组织在自身酶的作用下,发生软化和液化。
十:核酸降解
1. 质检结果质控不合格描述:
1.1 样本降解严重,可能影响测序结果准确性,继续检测存在一定风险。请确认是否继续检测,或者补送样本进行检测。

2. 质控不合格可能原因分析:
核酸降解的主要原因包括:
2.1 样本采集时间较久远或采集至提取阶段有反复冻融的现象;
2.2 样本采集后送达实验室前没有做好低温保存,保存的温度较高;
2.3 样本在福尔马林等组织固定液中浸泡时间过长,核酸受到理化因素影响发生降解;
2.4 没有很好抑制内源核酸酶的活性或有外源核酸酶污染。
十一:核酸提取量不足
1. 质检结果质控不合格描述:
1.1 提取后核酸总量Xng,未达继续检测标准,继续检测存在一定风险,请确认是否继续检测,或补送样本进行检测。
2. 质控不合格可能原因分析:
核酸提取总量不足的主要原因包括:
2.1 样本采集量不足,或DNA量不高,样本质量不好;
2.2 样本类型相关,血液样本中的肿瘤细胞来源的ctDNA含量太少,组织样本的取材部位不当等;
2.3 样本取材至提取期间间隔时间太久,期间反复冻融,或者存放温度过高,导致DNA降解严重,提取的有效检测DNA量不足。
十二:文库总量不够
1. 质检结果质控不合格描述:
1.1 建库后文库产出低,不足以进行杂交,建议补寄样品或更换样品进行检测(文库总量检测标准≥500ng)。
2. 质控不合格可能原因分析:
文库总量不够的主要原因包括:
2.1 核酸存在严重损伤或有抑制PCR反应的物质;
2.2 样本中提取的核酸浓度较低,起始上样量不足。
规范送检是样本顺利检测的首要环节,根据上述各类质检结果质控不合格描述和原因分析,小编为您找来了详细的送检规范流程,(详情请参考《凡事预则立,送检流程需规范!》),希望可以帮助您最大程度的降低取材和送检过程中的一些失误,大大提高送检样本的合格率。最后,小编简单的列举了一些本公司的检测项目送检的样本类型,供大家参考。

参考文献:
1.中华医学会检验医学分会,不合格静脉血标本管理中国专家共识[J],中华检验医学杂志,2020 43(10):956-963。
2.中国医师协会检验医师分会中医检验专业委员会, 北京中医药学会中医检验专业委员会, 韩冉,等。临床标本溶血检测与检验结果报告专家共识[J].实用检验医师杂志。
3.中国成人血脂异常防治指南修订联合委员会,中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)[J],中华全科医师杂志,2017,16(1):15-35。
4.万轲,胸腔积液引流沉淀物在恶性胸腔积液中的诊断价值[J],中国当代医药,2012(31):197-198。
5.国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会,肿瘤个体化治疗检测技术指南(试行)。
6.刘洪波. 石蜡切片常见的脱落原因及预防[C],中华医学会北京分会北京市病理技术年会暨北京市病理技术学术研讨会。
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